佳學(xué)基因如何進(jìn)行白化病基因檢測(cè)

樣本采集與處理

從該女性受試者及其父母處采集了血液樣本。她的弟弟則提供了唾液樣本。使用 QIAamp DNA Maxi Kit（Qiagen，德國(guó)希爾登）從全血中提取DNA；她弟弟的DNA則使用 Norgen Biotek 公司（加拿大安大略省索羅德）生產(chǎn)的唾液DNA提取試劑盒提取。

外顯子組測(cè)序

對(duì)該三人組（受試者、其母親和父親）進(jìn)行外顯子組測(cè)序，測(cè)序在佳學(xué)基因進(jìn)行，使用 Ion Proton 測(cè)序平臺(tái)以及 Ion AmpliSeq Exome RDY 文庫(kù)構(gòu)建試劑盒（Thermo Fisher Scientific），操作按照廠家說(shuō)明進(jìn)行。簡(jiǎn)要流程如下：每份樣本取100 ng基因組DNA（gDNA），配合5X Ion AmpliSeq HiFi Mix和12個(gè)獨(dú)立的外顯子引物池，進(jìn)行10個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物在引物消化（使用FuPa試劑）前混合。接著使用 Ion P1 和 Ion Xpress 條形碼接頭進(jìn)行連接反應(yīng)。隨后使用 Agilent 高靈敏度 DNA 試劑盒在 Agilent 2100 生物分析儀上純化并定量文庫(kù)，再進(jìn)行在 Ion OneTouch 系統(tǒng)上的乳液PCR。乳液和富集步驟使用 IonPI HiQ OT2 200 試劑盒完成。富集的Ion Sphere粒子通過(guò) Ion OneTouch ES（Life Technologies，美國(guó)加州卡爾斯巴德）處理。最后，在 Ion Proton 儀器上使用 IonPI HiQ Sequencing 200 試劑盒和 Ion PI chip V3（Thermo Fisher Scientific）進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。每個(gè)芯片加載兩個(gè)文庫(kù)，每次測(cè)序可獲得約13–15 Gb的序列數(shù)據(jù)。測(cè)序讀段比對(duì)至UCSC人類參考基因組GRCh37/hg19，并使用Ion Torrent分析流程識(shí)別變異（Life Technologies，美國(guó)加州卡爾斯巴德）。

為了尋找可能導(dǎo)致該女性表型的變異，基因檢測(cè)分析重點(diǎn)聚焦于與HPS相關(guān)的基因及TYR基因。變異篩選標(biāo)準(zhǔn)包括：錯(cuò)義突變，以及該女性與父母至少一方基因型不一致的變異。其弟弟的樣本采集在三人組外顯子組測(cè)序之后，通過(guò)PCR和Sanger測(cè)序進(jìn)行分析。每個(gè)樣本使用100 ng DNA進(jìn)行擴(kuò)增。為避免注釋錯(cuò)誤，篩選出的候選基因變異通過(guò)外顯子測(cè)序以及直接PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒的Sanger測(cè)序驗(yàn)證，弟弟的樣本也包括在內(nèi)。自動(dòng)化Sanger測(cè)序在佳學(xué)基因一代測(cè)序?qū)嶒?yàn)室使用ABI 3130系統(tǒng)和染料終止反應(yīng)化學(xué)進(jìn)行。電泳圖通過(guò)SnapGene Viewer（Dotmatics）查看。

酪氨酸酶基因變異的單倍型分型（Phasing）

為了確定c.575C>A（rs1042602；p.S192Y）變異的染色體來(lái)源，基因解碼人員使用Invitrogen公司（美國(guó)馬薩諸塞州沃爾瑟姆）的Zero Blunt TOPO PCR 克隆試劑盒對(duì)TYR基因第1外顯子的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆。使用Platinum SuperFi高保真聚合酶（Invitrogen，Thermo Scientific）產(chǎn)生平末端PCR產(chǎn)物，并將其克隆入pCR4Blunt-TOPO載體中。連接產(chǎn)物通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入One Shot化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌，陽(yáng)性克隆通過(guò)卡那霉素抗性篩選。使用QIAprep Miniprep Kit（Qiagen，德國(guó)希爾登）提取質(zhì)粒，并使用M13通用引物進(jìn)行測(cè)序。為了檢測(cè)TYR啟動(dòng)子變異c.-301C>T，按照上述方法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序。

致病基因鑒定檢測(cè)結(jié)果

外顯子組測(cè)序基因解碼

對(duì)該家系三人（受試者、母親和父親）進(jìn)行了外顯子組測(cè)序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)受試者在多個(gè)與HPS相關(guān)的基因中存在錯(cuò)義突變。在HPS1和HPS5基因中檢測(cè)到受試者的新發(fā)突變（de novo），且為雜合狀態(tài)。與HPS第2型相關(guān)的AP3B1基因變異以及HPS4基因中的變異也出現(xiàn)在受試者體內(nèi)，這些變異在其父母中的一方或雙方中也有發(fā)現(xiàn)。

使用1000基因組計(jì)劃第3階段的波多黎各人群數(shù)據(jù)（PUR）進(jìn)行等位基因頻率分析，發(fā)現(xiàn)與受試者具有相同基因單倍型的變異頻率如下：

• HPS4：34.61%

• HPS1：8.54%

• HPS4 和 HPS1 的組合單倍型：3.85%

• HPS5：8.65%
  其中，AP3B1基因區(qū)域在PUR人群中的等位基因頻率數(shù)據(jù)不可用。

鑒于家族中存在白化病史，且受試者表現(xiàn)出相關(guān)表型，我們進(jìn)一步分析了TYR（酪氨酸酶）基因的變異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)一個(gè)已知的致病變異 c.140G>A（rs61753180；p.G47D），以及兩個(gè)其他錯(cuò)義變異：c.575C>A（rs1042602；p.S192Y） 和 c.1205G>A（rs1126809；p.R402Q）。雖然半導(dǎo)體測(cè)序未能在母親的DNA中檢測(cè)到 c.1205G>A 變異，但后續(xù)驗(yàn)證階段的 Sanger 測(cè)序證實(shí)該變異確實(shí)存在。

受試者所攜帶的 TYR 單倍型在1000基因組波多黎各人群樣本中頻率為0.0%。而 c.575C>A 和 c.1205G>A 的聯(lián)合單倍型在PUR人群中的頻率為7.69%。

酪氨酸酶基因變異的單倍型分析（Phasing）

Sanger測(cè)序確認(rèn)這對(duì)兄妹在 TYR 基因變異 c.140G>A（rs61753180；p.G47D）、c.575C>A（rs1042602；p.S192Y） 和 c.1205G>A（rs1126809；p.R402Q） 上均為雜合狀態(tài)。同時(shí)，他們?cè)趩?dòng)子變異 c.-301C>T（rs4547091） 上則為純合狀態(tài)（見(jiàn)圖2a）。

對(duì)TYR第1外顯子的單倍型分析顯示，這對(duì)兄妹在兩個(gè)不同染色體上分別攜帶變異：c.140G>A 與 c.575C>A 位于不同的染色體上。由于 c.140G>A 來(lái)源于父系染色體，故推測(cè) c.575C>A 來(lái)自母系染色體（見(jiàn)圖2b）。在PUR人群中，c.[-301C;140A] 和 c.[-301C;575A;1205A] 兩種單倍型的頻率分別為 0.48% 和 1.92%。

圖2：酪氨酸酶基因變異的測(cè)序電泳圖及本基因解碼中白化病患者的單倍型圖示。

(a) 展示了該兄妹TYR基因中檢測(cè)到變異區(qū)域的 Sanger 測(cè)序電泳圖（上排：受試者；下排：患病弟弟）。兄妹二人在啟動(dòng)子變異 c.-301C>T（參考等位基因?yàn)镃，rs4547091） 上為純合，而在另外三個(gè)變異位點(diǎn)——c.140G>A（rs61753180；p.G47D）、c.575C>A（rs1042602；p.S192Y） 和 c.1205G>A（rs1126809；p.R402Q）——上均為雜合。

(b) 展示了患病兄妹體內(nèi) TYR 基因單倍型的染色體分布示意圖。對(duì)TYR基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，兩人均在父系染色體上攜帶單倍型 [c.-301C, c.140A]，在母系染色體上攜帶單倍型 [c.-301C, c.575A, c.1205A]。

致病基因鑒定基因檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明了什么問(wèn)題？

外顯子組測(cè)序結(jié)果并未支持HPS（Hermansky-Pudlak綜合征）的診斷，因?yàn)槭茉囌咴贖PS相關(guān)基因中的變異均為雜合狀態(tài)，或該基因型亦存在于未受影響的父母中。鑒于受試者存在眼部白化表現(xiàn)及家族病史（見(jiàn)圖1），我們進(jìn)一步分析了其他與白化病相關(guān)的基因。

在 TYR 基因中，受試者及其父親均攜帶一個(gè)常見(jiàn)于OCA1A患者中的致病性變異 c.140G>A（rs61753180；p.G47D），該變異小等位基因頻率（MAF）為 0.005?；蚪獯a表明，G47D錯(cuò)義變異可能影響酪氨酸酶與底物或輔助因子的結(jié)合。

此外，外顯子組測(cè)序還發(fā)現(xiàn)了 TYR 基因中另外兩個(gè)編碼區(qū)的變異：c.575C>A（rs1042602；p.S192Y，MAF = 0.308） 以及 c.1205G>A（rs1126809；p.R402Q，MAF = 0.183），分別位于外顯子1和外顯子4。受影響家庭成員在 S192Y 變異位點(diǎn)為雜合狀態(tài)，該位點(diǎn)位于酪氨酸酶的銅結(jié)合區(qū)域之一。

受試者與其母親同時(shí)攜帶熱敏性變異 R402Q，該變異在37°C時(shí)可使酪氨酸酶活性下降近75%，而在31°C時(shí)則不受影響。由于該熱敏效應(yīng)，多項(xiàng)基因解碼將 R402Q 與OCA白化病類型關(guān)聯(lián)，并強(qiáng)烈建議當(dāng) R402Q 與另一致病性TYR變異處于復(fù)合雜合狀態(tài)時(shí)應(yīng)視為致病。當(dāng)前仍需進(jìn)一步基因解碼 S192Y 與 R402Q 在同一染色體（cis）且與致病性變異（如 G47D）在異染色體（trans）上時(shí)的具體作用，但已有證據(jù)表明其與 OCA1 類型相關(guān)。

基因解碼也指出，R402Q 和 S192Y 變異與正常人群中黃斑結(jié)構(gòu)發(fā)育有關(guān)。而啟動(dòng)子區(qū)域變異 c.-301C>T（MAF = 0.567） 被發(fā)現(xiàn)可調(diào)節(jié) c.1205A 等位基因的外顯率。體外基因解碼表明，c.-301C 等位基因會(huì)降低酪氨酸酶表達(dá)，因?yàn)樗绊懥?OTX2 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。因此，若一個(gè)人同時(shí)純合攜帶 c.-301C 與 c.1205A，其患白化病的風(fēng)險(xiǎn)較高。

另一項(xiàng)基因解碼證實(shí)了這一觀點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn) c.-301C 與 c.575A 高度連鎖不平衡，且單倍型 c.[575A;1205A] 可能源自內(nèi)含子3內(nèi)的重組事件。此單倍型在歐裔人群中的頻率約為1%，若以純合形式或與一個(gè)致病性TYR變異處于trans狀態(tài)（例如 G47D），則足以確立遺傳診斷，尤其適用于輕度白化病患者。

該患病兄妹在所有 TYR 變異位點(diǎn)的基因型均相同（見(jiàn)圖2a）。單倍型分析顯示，S192Y 與 R402Q 同在母系染色體上，G47D 位于父系染色體上（見(jiàn)圖2b）。兩條染色體均攜帶啟動(dòng)子區(qū)域參考等位基因 c.-301C。這是文獻(xiàn)中首次報(bào)道c.-301C 與致病性G47D在trans狀態(tài)下，與常見(jiàn)的 S192Y 和 R402Q 變異共同存在的病例。

盡管這些變異的等位異質(zhì)性使我們難以精確判定造成該兄妹白化表現(xiàn)的具體等位組合，但可明確判斷兩份 TYR 基因拷貝均已受損。這一結(jié)果與其視力差、眼球震顫與色素減退的表型一致，符合 OCA1B 型白化病的診斷。

這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了白化病在臨床和分子診斷上的復(fù)雜性。

佳學(xué)基因評(píng)價(jià)

白化病的分子遺傳基礎(chǔ)表現(xiàn)出位點(diǎn)異質(zhì)性和基因異質(zhì)性。開(kāi)展盡可能全面的遺傳檢測(cè)，有助于醫(yī)生對(duì)白化病患者做出正確診斷，這一點(diǎn)隨著時(shí)間推移變得愈發(fā)重要，因?yàn)橐恍┩{生命的綜合征也會(huì)表現(xiàn)出類似的表型。進(jìn)行遺傳檢測(cè)時(shí)必須輔以遺傳咨詢，以幫助患者理解其表型的分子機(jī)制，并提供必要的預(yù)防措施以保障其健康。

本病例報(bào)告不僅展示了進(jìn)行遺傳檢測(cè)的重要性，同時(shí)強(qiáng)調(diào)了包含調(diào)控區(qū)分析、單倍型解析及群體遺傳數(shù)據(jù)的重要作用。